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實(shí)驗(yàn)干貨|蛋白質(zhì)濃度測(cè)定之BCA法的技巧

更新時(shí)間:2024-12-20      點(diǎn)擊次數(shù):211

BCA法是Lowry法的一種改進(jìn)方法。與Lowery法相比,BCA法操作起來(lái)更加簡(jiǎn)單方便,其試劑及其形成的顏色絡(luò)合物穩(wěn)定性更好,幾乎不受其他干擾物的影響,并且靈敏度高(微量檢測(cè)可達(dá)到0.5ug/ml),應(yīng)用起來(lái)更加靈活。BCA法與Bradford法相比,BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑(SDS,Triton X-100,Tween-20等)的影響。

BCA法實(shí)驗(yàn)的原理

BCA是一種穩(wěn)定的堿性水溶性復(fù)合物。在堿性條件下,蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+,Cu+與BCA Reagent A(含有BCA)相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng),形成紫色的絡(luò)合物。該水溶性的復(fù)合物在A562 nm處顯示強(qiáng)烈的吸光性,吸光度和蛋白質(zhì)濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。

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BCA實(shí)驗(yàn)物資與設(shè)備

? 物資清單

1. BCA試劑盒:通常包含BCA溶液A與B,使用前需按比例混合均勻。

2. 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品:一般采用牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 比色皿:可選用96孔板或其他規(guī)格,用于盛放樣品并進(jìn)行光度測(cè)量。

4. 離心管:用于樣品的制備與儲(chǔ)存。

5. 移液器及配套吸頭:用于精確量取與添加不同體積的液體。

6. 去離子水:用于配制溶液與稀釋樣品

? 設(shè)備介紹

光譜光度計(jì):在BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的過(guò)程中,光譜光度計(jì)是需要的儀器,它用于測(cè)量樣品在特定波長(zhǎng)(562納米)下的吸光度。在選擇光譜光度計(jì)時(shí),應(yīng)關(guān)注以下幾點(diǎn):

 • 精確度:儀器必須能夠精確讀取至0.001吸光單位的變化。

 • 波長(zhǎng)范圍:確保設(shè)備能夠覆蓋所需的測(cè)試波長(zhǎng),特別是BCA法所需的562納米。

 • 處理能力:根據(jù)實(shí)驗(yàn)規(guī)模,選擇具有合適讀取速度與樣品處理能力的光度計(jì),如單孔至多孔板光度計(jì)。

BCA實(shí)驗(yàn)操作步驟

一、微孔板檢測(cè)

① BCA工作液配制。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量,按50體積BCA 試劑A加1體積BCA 試劑 B(50:1)配制適量BCA工作液,充分混勻。

② 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。取一塊酶標(biāo)板(酶標(biāo)板的板底是不能用手去觸碰的,一般拿的是側(cè)壁),按下表數(shù)據(jù)加入試劑:

③ 樣品準(zhǔn)備:將待測(cè)蛋白樣品用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度,取20 ul樣品,加入200 ul BCA工作液(蛋白液:工作液=1:20)。加樣時(shí)槍要輕柔吹打,將其中液體混勻。

④ 振蕩混勻后,37℃放置20 ~ 30 min。冷卻至室溫。顏色變化如下圖:

⑤ 用酶標(biāo)儀測(cè)定A562 nm處的吸光值,以不含BSA的吸光值為空白對(duì)照。

⑥ 以蛋白含量(ug)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

⑦ 根據(jù)測(cè)得的吸光值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可計(jì)算出樣品的蛋白含量。

⑧ 計(jì)算蛋白濃度:以查得的蛋白含量除以樣品體積20 ul,再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得到待測(cè)樣品的實(shí)際濃度。

二、微孔板檢測(cè)

① BCA工作液配制。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量,按 50 體積BCA Reagent A加1體積BCA Reagent B(50:1)配制適量BCA工作液,充分混勻。

② 選取7支潔凈試管,其中6支標(biāo)號(hào)1~6號(hào)管(包含第1支空白管),另外1支標(biāo)記待測(cè)管。按照下表用移液器準(zhǔn)確移取相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液或待測(cè)樣品、蒸餾水和BCA工作液于試管中。

③ 取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(根據(jù)情況用去離子水適度稀釋?zhuān)?,以蛋白液:工作?1:20 的比例混勻。37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。

④ 然后吸取各試管中的溶液于比色皿中并用分光光度計(jì)的562nm波長(zhǎng)比色測(cè)定吸光度值。

BCA實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

 • 為保證蛋白濃度測(cè)量的準(zhǔn)確性,最好做3個(gè)復(fù)孔,必要時(shí)剔除離群值。

 •  BCA法測(cè)蛋白濃度易受時(shí)間及溫度的影響,所以最好每次測(cè)定都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 • 加樣時(shí)一定要準(zhǔn)確加樣且盡可能避免氣泡產(chǎn)生,以免影響測(cè)量(加樣結(jié)束可以用注射器戳破氣泡,并將96孔板放在搖床上混勻片刻,以使樣品與工作液充分接觸)。

 • 孵育結(jié)束應(yīng)盡快檢測(cè)吸光度,并盡可能加快檢測(cè)速度,以免帶來(lái)誤差。


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